엔도톡신 측정법_비탁법

엔도톡신이란?

 

엔도톡신은 세균이 죽을 때 노출 되는 독소을 말한다.

 

이 독소는 인체 내에서 발열을 일으키며 과도한 면역반응을 유발하여 패혈증, 패혈성 쇼크를 일으킬 수 있어 제약회사에서 약품을 제조할 때 관리해야 하는 물질이다.

 

그람 음성균의 세포막, 세포벽의 외막인 lipopolysaccharide(LPS)가 엔도톡신으로 작용하며, 균이 아니기 때문에 균 사멸 조건인 습열멸균(121oC, 15분)으로는 없어지지 않는다.

 

더 극한의 조건인 250oC, 30분 이상으로 해줘야 엔도톡신이 불활성화된다.

 

찰스리버 엔도톡신 시약

 

엔도톡신 측정법 비탁법

 

비탁법은 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시약의 겔화과정에서의 탁도 변화를 지표로 하는 시험법이다.

 

엔도톡신 측정법 비탁법 필요시약

 

- LAL 시약: 투구게의 피에서 뽑은 혈구세포를 정제하여 만든 생물학적 제제 (미생물에 노출되면 응고되어 미생물의 침입을 막는 투구게의 원리를 이용)

- Endotoxin Specific buffer: LAL 시약을 녹이는 버퍼

- LAL water: LAL 시약과 반응하지 않는 물 (엔도톡신 수준 < 0.005 EU/ml)

- CSE(Control Standard Endotoxin): 아주 순수하게 LPS만을 정제한 물질 (LPS에 사람의 혈청 알부민, PEG, 녹말과 같은 안정화 물질을 넣어 만들어 짐)

* CSE와 LAL 시약의 Lot#가 맞아야 사용가능하다. (찰스리버 홈페이지에서 확인 가능)

 

엔도톡신 측정법 비탁법의 시험방법

 

* 엔도톡신 측정 전에 최대유효희석배수를 구해 의약품을 최대유효희석배수 안에서 희석하여 엔도톡신을 측정하여야 한다.

 

최대유효희석배수 계산

 

1. 계산이 끝났다면 Sample을 LAL water에 희석한다. (희석은 한 번에 10배를 넘지 않으며 한 번에 2ml 이상 제조)

 

2. CSE를 LAL water에 용해하여 50EU/ml의 stock solution을 만들어준다.(찰스리버 홈페이지에서 Lot#를 입력하면 LAL water를 얼마나 투여해야 하는지가 나온다)
* vortexing을 충분히 해줘야 한다.

 

3. CSE stock solution을 LAL water를 사용하여 각각 5, 0.5, 0.05, 0.005 EU/ml로 희석하여 standard solution을 만들어 준다.

 

4. 96 well plate(endofree)에 vortexing을 충분히 해준 blank(LAL water), standard와 sample을 100ul 깔아준다. (Blank, Standard는 각각 2 well씩, Sample은 4 well씩 깔아준다)

 

5. LAL 시약을 endotoxin specific buffer 5.2ml로 용해시킨다. (LAL시약 통에 endotoxin specific buffer 1 vial을 모두 부어서 넣으면 됨)
* 절대 vortexing 하지 않고 그냥 굴려서 섞어준다.(거품이 생기지 않게 한다)

 

6. Sample positive control군에 standard 5EU/ml을 10ul 넣어준다. (깔아준 4 well 중에 2 well에)

 

7. 용해시킨 LAL시약을 깔아준 모든 well에 100ul씩 넣어준다.(반응시간이 빠르기 때문에 신속정확하게 넣어준다)

 

8. plate를 endoscan 기기에 넣고 shaking 10초 한 후에 측정한다.

 

엔도톡신시험결과 확인방법

 

엔도톡신 결과를 확인하면 값이 나오는 경우도 있지만, 예시로 < 0.1 EU/ml 이런 식을 나오는 것을 확인할 수 있을 것이다.

 

이 결과가 나온 과정에 대해 설명을 하자면 standard 중에서 가장 낮은 농도의 값(사용하는 plate에 측정 가능한 가장 낮은 농도의 standard 값이 적혀 있다)에서 샘플의 희석된 배수만큼을 곱해서 나온 값이다.

 

예) 0.005EU/ml(standard 중 가장 낮은 농도 값) X 20(희석배수) = 0.1 EU/ml 이므로 0.1EU/ml이 측정할 수 있는 가장 높은 농도였기 때문에 이 값보다 낮을 것이다라고 결과 값이 나올 수밖에 없는 것이다.

추가적으로 엔도톡신 결과를 확인할 때 결과 값이 신빙성이 있는지를 확인하기 위해 몇 가지 더 확인해줘야 한다.

1. Standard Curve의 R값이 0.980 이상인지
2. Blank의 반응시간(reaction time)이 가장 낮은 검출한계의 농도 반응시간보다 오래 걸리는지
3. 반복 간 편차(CV)가 기준 미만인지(10%)
4. 회수율(Rcovery rate)이 50~200% 사이인지
5. Sample의 엔도톡신 농도 값이 검출한계의 농도보다 낮은지

위의 5가지를 확인한 후에 만족해야 엔도톡신의 결과 값이 신빙성이 있다고 판단할 수 있습니다.

참고 문헌: Endosafe R Products and Services, 엔도톡신 시험법

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