계대배양 실험방법 (Subculture protocol)

대학원에 입학하면 세포실험을 하게 되는 경우가 있는데, 그때 가장 먼저 배우게 되는 실험이 계대배양입니다.

 

계대배양은 세포실험과정에서 가장 간단하지만 가장 기본이 되는 실험입니다.

 

계대배양을 하는 이유는 세포의 활성과 특성을 동일하게 유지시키기 위함으로 계대배양을 제대로 하지 않으면 실험결과의 재현성이 떨어질 수 있습니다.

 

그럼 지금부터 계대배양의 준비과정부터 실험과정을 설명드리겠습니다. (부착세포의 계대배양 실험입니다)

 

계대배양

 

계대배양 준비과정

 

- 37℃ water bath에 serum media, DPBS, trypsin 데우기.

 

- 코니칼튜브(50ml, 15ml)를 70% 에탄올로 닦아 크린벤치에 넣고 UV 켜기. (약 30분 정도)

 

- 30분 후 1 ml 파이펫, 100ul 파이펫, serum media, DPBS, trypsin을 70% 에탄올로 닦은 후 크린벤치에 넣는다.

 

계대배양 실험과정

 

 ① Serum media를 50ml 코니칼 튜브에 덜어 둔다.

 

 ② 배양 중인 25T flask를 가져와 suction 한다.

 

 ③ DPBS 3ml로 washing 후 suction 한다.

 

 ④ Trypsin 500ul를 넣어준 뒤 spreading 시키고 incubator에 1분 정도 넣어둔다.

 

 ⑤ Serum media를 2ml 넣고 cell을 모아 15ml 코니칼 튜브에 옮긴다.

 

 ⑥ Centrifuge에 넣고 1000 RPM, 2분, RT 설정하여 돌린다. (cell down-balance 맞춰줄 것)

 

 ⑦ Centrifuge가 돌아가는 동안, 새로운 25T에 5ml serum media를 넣어 놓는다.

 

 ⑧ Centrifuge에서 15ml 코니칼 튜브를 꺼내고 크린벤치에서 상층액을 suction.

 

 ⑨ 15ml 코니칼튜브에 가라앉은 cell을 1ml serum media로 천천히 파이펫팅하면서 풀어준다.

 

 ⑩ 정적 volume(50ul, 100ul, 200ul 등)을 serum media가 담긴 25T flask에 옮긴다. (cell이 뭉치지 않게 dropwise로 곳곳에 떨어 뜨려 준다)

 

 ⑪ 상하좌우로 spreading 시켜준 후 incubator에 넣는다.

 

계대배양

 

이상 계대배양 준비과정과 실험과정이었습니다.

 

계대배양은 cell마다 상이하기 때문에 위의 준비과정과 실험과정을 완전히 따라 한다기보다는 참고해 주시면 좋을 것 같습니다.

 

간단한 과정이지만 곳곳에 숙련된 기술이 필요한 실험이니 몸에 익혀 숙달하는 과정이 필요합니다.

 

추후에 stock 잡는 방법과 푸는 방법에 대해 포스팅하겠습니다.

 

읽어주셔서 감사합니다.